Góp phần nghiên cứu thành phần hoá học của cây lược vàng (phần 2) – Đông Y Việt Bắc
Home / Đông y & Đông dược / Góp phần nghiên cứu thành phần hoá học của cây lược vàng (phần 2)

Góp phần nghiên cứu thành phần hoá học của cây lược vàng (phần 2)

cay luoc vang

Trong quá trình nghiên cứu hoá thực vật cần phải tôn trọng nguyên tắc chung là không được làm thay đổi cấu trúc hoá học có sẵn trong thực vật và không làm ảnh hưởng đến thành phần hoá học của chúng tại thời điểm lấy mẫu. Như vậy, ngay sau khi thu hái mẫu xong, cần phải tiến hành diệt men để tránh sự chuyển hoá do các quá trình sinh tổng hợp xảy ra ở thực vật, sấy khô ở nhiệt độ thích hợp, bảo quản mẫu trong điều kiện khô ráo.

3. Vật liệu và thực nghiệm

3.1. Vật liệu, phương tiện sử dụng trong nghiên cứu:

Máy cất quay chân không,  cân điện tử có độ chính xác tới 10-3  , dụng cụ bằng thuỷ tinh: Bình cầu, cốc, ống sinh hàn, …

Thuốc thử thích hợp như NH3, CHCl3, HCl, Mayer, Dragendooc, Axit Pycric, H2SO4….

Các dung môi chiết xuất dùng trong nghiên cứu: Nước tinh khiết, cồn, Cloroform, Etyl Acetat…

3.2. Thực nghiệm

3.2.1. Nguyên tắc chung.

Trong quá trình nghiên cứu hoá thực vật cần phải tôn trọng nguyên tắc chung là không được làm thay đổi cấu trúc hoá học có sẵn trong thực vật và không làm ảnh hưởng đến thành phần hoá học của chúng tại thời điểm lấy mẫu. Như vậy, ngay sau khi thu hái mẫu xong, cần phải tiến hành diệt men để tránh sự chuyển hoá do các quá trình sinh tổng hợp xảy ra ở thực vật, sấy khô ở nhiệt độ thích hợp, bảo quản mẫu trong điều kiện khô ráo.

Để tách các chất ra khỏi thực vật có thể được tiến hành bằng nhiều cách khác nhau: ép lấy dầu béo, lôi cuốn bằng hơi nước để tách các tinh dầu, ngâm chiết bằng dung môi hữu cơ… Tuy nhiên có hai phương pháp phổ biến hơn cả để tách các chất ra khoir thực vật.

Cách 1: Trước tiên, chiết bằng dung môi rượu – nước để tách hầu hết các chất ra khỏi thực vật. Sau đó, chiết sang lọc bằng các dung môi từ không phân cực đến phân cực. Các dung môi chiết chứa các hợp chất hữu cơ có độ phân cực gần nhau sẽ được cất đưổi dung môi, bảo quản dung cho các quá trinh tách tiếp theo.

Cách 2: Chiết và phân lập các chất trong mẫu thực vật bằng các loại dung môi từ không phân cực đến các dung môi có độ phân cực tăng dần: n- hexan, clorofom, etylaxetat, n- butanol, methanol, etanol- nước.

3.2.2. Định tính các nhóm hợp chất

a. Định tính alcaloid

Định tính alcaloid trong cây, chúng tôi đã tiến hành như sau: lấy khoảng 10g nguyên liệu khô, sau đó được tẩm bằng hơi NH3 trong bình hút ẩm cho vào bình tam giác và rót vào khoảng 60ml CHCl3 lắc đều rồi để yên. Sau đó dịch chiết được lọc và chuyển vào phễu chiết. Tiếp theo cho vào dung dịch này khoảng 10ml HCl 10%, hỗn hợp này được lắc cẩn thận trong vài phút rồi để yên, sau đó chiết lấy phân trên (phần tan trong dung dịch HCl). Lấy phần dung dịch này để thử định tính.

– Để định tính có thể dùng các thuốc thử sau.

+ Thuốc thử Dragendoff: cho vài giọt thuốc thử này vào dung dịch cần định tính nếu thấy kết tủa màu da cam thì chứng tỏ có alcaloid.

+ Thuốc thử Wagner: cho vài giọt thuốc thử này vào dung dịch cần định tính nếu thấy có eets tủa màu nâu chứng tỏ có alcaloid.

 Kết quả: có alcaloid.

b. Định tính flavonoid

Cho  khoảng 5 gam nguyên liệu đã giã nhỏ vào bình cầu, sau đó thêm khoảng 50ml cồn 95% và đun trên bếp cách thuỷ cho đến sôi, lắc bình vài lần, đóng nút bình lại và để khoảng 3 – 4 h (có thể để qua đêm) dịch chiết còn lại được rót ra và cô đặc lại đến còn khoảng 15ml. Được chia làm 3 phần và chuyển vào trong 3 ống nghiệm.

– Phản ứng xianidin: thêm vào ống nghiệm thứ nhất khoảng 3ml dung dịch HCl đặc và một mảnh kim loại Mg, quan sát trong 10 phút, nếu có màu từ vàng, đỏ, xanh thì chứng tỏ có flavonoid. Thêm vào ống nghiệm thứ 2 khoảng 2ml dung dịch HCl, đun cách thuỷ 5 phút nếu có màu đỏ.

Ống thứ 3 làm đối chứng.

– Phản ứng với thuốc thử : FeCl31%+K3[Fe(CN)6]  dung dịch cho màu xanh thẫm.

– Phản ứng với H2SO4 cho màu hồng nhạt

Kết quả: có flavonoid.

c. Định tính Coumarin

Trong bình cầu trộn khoảng 10 gam nguyên liệu khô đã giã nhỏ, thêm khoảng 80ml cồn 95%, đun sôi trên bếp cách thuỷ và để lại 3 – 4h, luôn lắc trộn. Dịch chiết được gạn lọc và làm bay hơi còn khoảng 5ml. Tiến hành phản ứng sau:

Trong 2 ống nghiệm, rót 2ml dịch chiết cồn, mỗi ống nghiệm thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%. Sau đó đun cả 2 ống nghiệm trên bếp cách thuỷ và làm lạnh. Trong mỗi ống rót vào khoảng 4ml nước cất. Nếu như trong ống đã được thêm kiềm và nước trong suốt hơn so với ống nghiệm không có kiềm, có thể khẳng định có phản ứng lacton. Khi axit hoá bằng vài giọt HCl đặc thì thấy xuất hiện màu vàng đục hoặc kết tủa bông thì kết luận có cumarin.

Kết quả: có coumarin.

d.  Định tính saponin

Để xác định saponin trong mẫu chúng tôi làm như sau: lấy vài gam nguyên liệu đã nghiền nhỏ, lắc mạnh với 5 – 10ml nước, dấu hiệu đầu tiên có saponin là xuất hiện bọt bền vững.

+ Bọt bảo toàn 15 phút.

++ Bọt bảo toàn 30 phút.

+++ Bọt bảo toàn trên 60 phút.

Có thể xác định sơ bộ saponin steroid và saponin triterpen như sau: lấy khoảng 0,5 gam nguyên liệu khô và nghiền nhỏ, thêm vào 5ml nước cất. Hỗn hợp được đun nóng trong ống nghiện đến sôi trên bếp cách thuỷ, làm lạnh và lọc lấy nước. Để xác định sự có mặt của saponin ta lấy 2 ống nghiệm. Trong ống 1, thêm 5ml dung dịch HCl 0,1N (pH = 1), ống nghiệm 2 thêm vào 5ml dung dịch NaOH 0,1N (pH = 13).Trong cả 2 ống nghiệm thêm vào 2 – 3 giọt nước sắc và lắc thật mạnh trong khoảng 1 phút.

Nếu như trong cả 2 ống nghiệm bọt được tạo thành bằng nhau cả về kích thước, số lượng và sự bền vững của cột bọt thì nguyên liệu chứa saponin triterpen. Nếu như ở pH = 13 bọt lớn hơn một vài lần về số lượng và sự bền vững thì nguyên liệu chứa saponin steroit.

Kết quả: có saponin steroid.

e. Định tính glycosid tim

Lấy 10 gam nguyên liệu khô đã giã nhỏ vào bình tam giác thêm vào 100ml cồn 20 – 30% và để lại sau 1 ngày, thỉnh thoảng khuấy trộn,l sau đó lọc thu được dịch chiết. Để tủa chất bẩn trong dịch chiết ta tiến hành tuả lần lượt bằng chì axetat và dung dịch natrisunfat bão hoà. Từ dung dịch đã lọc bỏ chất bẩn lấy các glycozet ra bằng hỗn hợp CHCl3 và cồn (3:1), phân đoạn khoảng 20ml dịch chiết CHCl3 – cồn của các glycosid được làm khô bằng natrisunfat khan và lọc vào bình cầu. Chưng cất thu hồi dung môi đến khô trên bếp cách thuỷ.

Hỗn hợp các glycosid thu được từ cách điều chế trên được xác định bằng phản ứng định tính Keller – Kiliani: trong 2ml axit acetic băng chứa oxit sắt ( trộn 99ml axit axetic băng với 1ml dung dịch FeCl3 5%) được hoà tan 1 -2 mg glycosid, dung dịch được chuyển sang theo thành ống nghiệm của một ông nghiệm khác chứa sẵn 2ml H2SO4 đặc sao cho phân làm hai lớp, ở giới hạn hai lớp xuất hiện màu nâu hoặc nâu đen, ở trên mặt vành màu nâu từ từ xuất hiện lớp màu xanh lục hoặc xanh trong vòng 1 – 2 phút thì kết luận có glycosid tim.

Kết quả: có glycosid tim

f. Định tính đường

Nguyên liệu được nghiền nhỏ, ngâm trong cồn 90%, chiết lấy dung dịch, thêm 50ml dung dịch vào ống nghiệm sau đó thêm 3ml dung dịch thuốc thử Fellinh, đun sôi 3 phút, nếu có kết tủa đỏ gạch thì chứng tỏ có đường khử.

Kết quả: có đường khử.

g. Định tính cyanua

Dùng giấy lọc tẩm dung dịch axit picric 1% để 1-2 phút, sau đó nhúng giấy vào dung dịch Na2­CO3 rồi để cho giấy khô. Bình cầu đụng nguyên liệu tươi đã được nghiền nhỏ trộn với axit lactric, đậy bình cầu bằng nút cao su có cắm sinh hàn khí. Treo giấy picrat vào trongn bình đó, đun bình trên bếp cách thuỷ sau một thời gian nếu thấy giấy picrat chuyển sang màu vàng nâu chứng tỏ nguyên liệu có chứa cyanua.

Kết quả: có cyanua.

Normal 0 false false false EN-US X-NONE X-NONE MicrosoftInternetExplorer4

3.2.3. Định lượng các nhóm hợp chất bằng phương pháp trọng lượng

a. Phương pháp xác định hàm lượng chất hoà tan

Nguyên liệu được sấy khô ở 50oC đến khối lượng không đổi, sau đó giã nhỏ cân chính xác khối lượng gói vào giấy lọc, cho vào cốc, cho thêm nước cất với thể tích nước mỗi lần như nhau, rồi đun trên bếp cách thuỷ ở 100oC.  Chiết gạn nhiều lần đến khi cân phần bã đã sấy khô thấy khối lượng không đổi là được. Hàm lượng chất hoà tan theo công thức sau:

Y (%) = [(m-n)/m] * 100

Y: Phần trăm hàm lượng chất hoà tan (%)

m: Khối lượng mẫu khô ban đầu (g)

n: Khối lượng mẫu sau khi hoà tan và sấy khô (g)

b. Phương pháp định lượng các chất tan tan trong dung môi etylacetat

Nguyên liệu khô được chiết trong thiết bị soxhlet với dung môi là C2H5OH 70%, kết thúc chiết khi dịch được chiết trở thành không màu. Dịch chiết cồn bằng thiết bị soxhlet được lọc qua giấy lọc để loại bỏ vụn dược liệu, sau đó cô đặc bằng cách thu hồi dung môi dưới áp suất giảm. Dịch chiết đặc này được chiết lại bằng nước nóng và clorofom (CHCl3) nhiều lần để loại tạp chất màu và chất béo. Phần tan trong nước được chiết tiếp với etylacetat nhiều lần. Thu được dịch chiết etylacetat màu vàng (sau khi loại dịch nước).  Dịch chiết này được thu hồi dung môi dưới áp suất giảm ta sẽ thu được cặn , sấy cặn ở 500C, ta thu được cao toàn phần

Hàm lượng được xác định theo công thức sau:

Trong đó: X(%)=(b/a)*100 (1)

a: Trọng lượng nguyên liệu khô (g).

b: Trọng lượng cao sấy khô (g).

X: Hàm lượng cao etylacetat trong dược liệu khô (%).

c. Phương pháp định lượng các chất tan tan trong dung môi clorofom.

Lấy dịch chiết cồn 70% thu được ở trên, ngâm với HCl 6N ,sau 12 giờ, ta cho NH3 vào đến khi pH của dung dịch khoảng 10-13, sau đó chiết với CHCl3 cho đến khi dịch chiết không màu, thu hồi CHCl3 dưới áp suất giảm, ta thu được cao, đem sấy cao ở 500C và xác định khối lượng theo (1).

4. Kết quả nghiên cứu

4.1. Kết quả định tính các loại nhóm hợp chất

Để tiến hành định tính các loại nhóm chất trong mẫu nghiên cứu, chúng tôi sử dụng các phương pháp đã nêu và thu được kết quả thể hiện ở các bảng sau:

Bảng 1. Kết quả định tính các loại nhóm chất

Nhóm

hợp chất

Thuốc thử

Hiện tượng

Kết luận

Ancaloid 1. Dragendooc kết tủa vàng

2.Phản ứng Wagner kết tủa vàng

 

 

Flavonoid

1. Phản ứng Xianidin của Wilstatter Dung dịch nhạt màu dẫn đến màu đỏ nhạt

2. FeCl31%+K3[Fe(CN)6] màu xanh thẫm

3. H 2SO4 Hồng nhạt

Coumarin Phản ứng tạo kết tủa bông Có kết tủa

Saponin Phản ứng tạo bọt Có bọt

Glucosid tim Phản ứng Keller-Kaliani

 

xuất hiện vạch màu nâu đen

Đường khử Fellinh Kết tủa đỏ gạch

Cyanua Giấy picrat Vàng nâu

 Nhận xét: Qua bảng trên, thấy trong mẫu nghiên cứu có chứa nhiều nhóm hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học cao như ancaloid, flavonoid, saponin, glucosid tim, coumarin và xuất hiện cyanua trong mẫu nghiên cứu.

4. 2.Kết quả định lượng một số loại nhóm chất

4.2.1. Hàm lượng chất hoà tan

Bảng 2: Hàm lượng chất hoà tan trong cồn 70% của mẫu khô (độ ẩm 24%)

Mẫu nghiên cứu Khối lượng mẫu khô ban đầu (g) Khối lượng bã khô sau khi chiết (g) Hàm lượng  (%)
1 15,564 13,402 13,893
2 7,534 6,602 12,367
3 10,245 9,008 12,078
Hàm lượng chất hoà tan trung bình là:                                     12,780%

  Bảng  3  : Hàm lượng chất hoà tan trong nước của mẫu tươi

Mẫu nghiên cứu Khối lượng mẫu ban đầu (g) Khối lượng bã khi chiết, sấy ở 50oC (g) Hàm lượng  (%)

1

74,426

2,829

96,199

2

63,456

2,023

95,884

3

65,089

2,078

95,732

Hàm lượng chất hoà tan trung bình là:                                          95,938%

Nhận xét: Từ bảng trên, hàm lượng chất hoà tan trong nước của cây lược vàng trong dung môi cồn 70% tương đối nhỏ so với trong dung môi là nước, do đó nước là dung môi chiết tốt các chất có trong mẫu cây Lược vàng.

4.2.2. Hàm lượng các chất tan trong etylacetat

Bảng 4: Hàm lượng các chất tan trong etylacetat chiết mẫu bằng dung môi là nước

Mẫu nghiên cứu

Khối lượng nguyên liệu tươi (g)

Khối lượng cao (g)

 

Hàm lượng  (%)

1

74,426

0,093

0,125

2

63,456

0,072

0,114

3

65,089

0,0685

0,105

Hàm lượng  trung bình là:                                      0,115%

 Bảng 5: Hàm lượng các chất tan trong etylacetat khi chiết mẫu bằng dung môi cồn 70%

Mẫu

nghiên cứu

Khối lượng nguyên liệu khô (g)

Khối lượng cao (g)

Hàm lượng (%)

1 15,564

0,352

2,2616

2 7,534

0,212

2,8139

3 10,245

0,253

2,4695

Hàm lượng trung bình:                                                                  2,515%

 Qua hai bảng trên nhận thấy các chất tan được trong dung môi etylacetat của dich chiết cồn 70% lớn hơn so với của dịch chiết nước, trong dịch chiết etylacetat chủ yếu các hợp chất có độ phân cực tương đương với etylacetat tan trong đó, như flavonoid, saponin, coumarin,…, do đó có thể sử dung dung môi này để chiết các nhóm chất có độ phân cực tương đương với etylacetat.

4.2.3. Hàm lượng các chất thu được theo cách thực nghiệm 3.2.3.c trong cây Lược vàng.

Bảng 6: Hàm lượng các chất tan trong clorofom trong dịch chiết cồn

Mẫu nghiên cứu

Khối lượng nguyên liệu khô (g)

Khối lượng cao  (g)

Hàm lượng (%)

1

15,564

0,072

0,4626

2

7,534

0,036

0,4778

3

10,245

0,053

0,5173

Hàm lượng ancaloid trung bình:                                                     0,4859

 

  Theo cách thực nghiệm 3.2.3.c thì trong dịch chiết clorofom chủ yếu là các chất có độ phân cực tương đương với clorofom như các ancaloid, saponin,… nhưng chủ yếu vẫn là các alcaloid, hàm lượng các chất này tương đối lớn trong cao thu được, do đó có thể sử dụng cách thực nghiệm này để chiết các alcaloid.

5. Kết luận

Qua nghiên cứu bằng các phương pháp định tính như đã trình bày ở trên, chúng tôi đưa ra kết luận trong cây lược vàng có các hoạt chất sinh học:

Ancaloid

Flavonoid

Coumarin

Saponin

Glycosid tim

Đường khử

Cyanua.

 Bs. Hoàng Sầm

Doctor SAMAN

Trả lời

Thư điện tử của bạn sẽ không được hiển thị công khai. Các trường bắt buộc được đánh dấu *